Development of a novel culture-independent method for comprehensive detection and identification of beer-spoilage microorganisms

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Masaki Shimokawa (1), Kazumaru Iijima (1), Yasuo Motoyama (1), Koji Suzuki (1), Hiromi Yamagishi (1); (1) Asahi Breweries, Ltd., Moriya, Japan

BCOJ Symposium
Sunday, August 14  •  2:00–3:15 p.m.
Plaza Buiding, Concourse Level, Governor’s Square 14

醸造所における微生物学的品質管理におけるビール腐敗微生物の検出には、培養法がよく用いられる。それは時間がかかるプロセスであり、培養のために3〜14日を要する。従って、ビール中のビール腐敗微生物を直接検出するための培養に依存しない方法が開発されている。従来、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が、ポリカーボネート膜上に捕捉された細胞からのDNA抽出法と組み合わされている。細胞はポリカーボネート膜の表面上に捕捉されるので、その後のDNA抽出のために膜から容易に放出可能である。しかしながら、ポリカーボネート膜による濾過量は、濾過能力が低いためにかなり制限されており、ビール中の低濃度の汚染微生物を検出することは困難である。.我々の新しい方法においては、微生物は膜マトリックス内に閉じ込められているが、その高い濾過性の理由から細胞膜の回収のためにセルロース膜が選択された。この困難を克服するために、私たちは、圧力サイクル技術を用いてセルロース膜内の捕捉された細胞から直接DNA抽出および回収する新規な方法を開発した。Barocyclerを使用する圧力サイクリング技術は、反応容器内における非常に高い（最大235MPa）圧力と常圧条件との間の迅速なサイクルを可能にする。高圧および低圧条件の急速なサイクルは、DNA抽出溶液の膜マトリックスへの浸透を促進し、細胞を効果的に破壊する。しかしながら、このアプローチのみでは、ビール腐敗微生物の10 ¹-10 ³細胞/膜の検出が可能となる。感度を向上させるために、担体DNAを吸着競合剤としてDNA抽出溶液に加え、抽出されたDNAが膜マトリックスに吸着するのを防止した。さらに、エタノール沈殿法を加えてDNAを濃縮し、さらにDNA回収を強化するために、高い圧力（300MPa）を採用した。我々の修正されたプロトコルでは、 ラクトバチルス・ブレビスおよびペディオコッカスのdamnosus含む主要ビール混濁乳酸菌の検出限界は、10 ⁰細胞/膜（ビールの最大3,000ミリリットルまで）と低いことが見出された。さらに、このプロトコルは野生酵母（ サッカロミセス及びデッケラ / ブレタノマイセス ）種にも適用可能であることが示され、また同一の検出限界が達成された。対照的に、いくつかのペクチネータス株の検出限界100細胞/膜を達成するためにはセルロース膜の孔サイズの最適化が必要とされる。この修正されたアプローチは、ビール混濁ペクチネータス種のすべてに適用できるだけでなく、ビール混濁メガスフェラ種にも適用可能であることが判明した。この一連の測定は、最終的に100細胞/膜の検出限界で20種以上のビール腐敗微生物の検出を可能にし、8時間以内にビール腐敗種の包括的な培養に依存しない同定を可能にする。まとめると、我々の新しい方法は、非常に迅速で高感度な培養に依存しない検出および同定方法であると考えられ、醸造業界において重要な一歩を踏み出すものである。

2008年3月、環境微生物学を専攻した北海道大学から環境工学のME学位を取得しました。2011年9月より、品質管理センターでビール腐敗微生物の検出技術開発、醸造所での微生物品質保証に取り組んでいます。